CAS的原理
在讲述原理之前，先了解两个在CA设备中容易混淆的概念：一个是加解扰（Scrambling-Descrambling），另一个是加解密 （Encryption-Decryption）。加解扰技术被用来在发送端CA系统的控制下改变或控制被传送的服务（节目）的某些特征，使未被授权的用 户无法获取该服务提供的利益；而加密技术被用来在发送端提供一个加密信息，使被授权的用户端解扰器能以此来对数据解密，该信息受CA系统控制，并以加密形 式配置在传输流信息中以防止非授权用户直接利用该信息进行解扰，不同的CA系统管理和传送该信息的方法有很大不同。简单地说就是：加扰是通过控制字(CW,Control word)对传输流进行按位加密的过程，而加密部分实际完成对控制字（CW）的保护。这两种技术是CA系统重要的组成部分，在技术上有相似之处，但在CA系统标准中是独立性很强的两个部分。在目前各标准组织提出的条件接收标准中，加扰部分往往力求统一，而在加密部分则一般不作具体规定，是由各厂商定义的部分。条件接收的核心是控制字CW传输的控制。在采用MPEG-2标准的数字电视系统中，与节目流条件接收系统相关的有两个数据流：授权控制信息 ECM（Entitle Control Message）和授权管理信息EMM（Entitle Manage Message）。由业务密钥SK（Service Key）加密处理后的CW在ECM中传送，ECM中还包括节目来源、时间、内容分类和节目价格等节目信息。对CW加密的SK在EMM中传送，而SK在传送 前要经过用户个人分配密钥PDK（Personal Distribute Key）的加密处理，EMM中还包含地址、用户授权信息。起始控制字（CW）作为解扰密钥使用。解扰密钥是系统安全的基本要素。为此对CW本身（以及系统数据的其他部分）要用一个加密密钥通过加密算法对它进行 加密保护，这个加密密钥只是一个用来变化加密算法结果的任意数。固定这个密钥是不适用的（安全性差），应当采用变化密钥，通过CA控制器用人工的或其他自 然方式产生新的随机数。在具体应用中，通常由服务提供商产生用来控制其提供的服务，所以把它称为业务密钥SK。SK的使用和用户付费条件有关。CW虽已由SK加密，但这个密钥如果还是可以让任何人读取，网络运营商还是难以控制到特定的用户，安全性还是存在问题，必须对SK再进行加密保护。由于 共用网络寻址模式中数据包是按用户地址传送的，每个终端设备有一个不重复的惟一的地址码，就可以采用地址码来对SK加密。在实际 使用中，终端设备的地址一般是公开的，且基本不变，所以往往用和这个地址码相关联的一个数列来进行加密，称为个人分配密钥（PDK）。PDK一般由CA系 统设备自动产生并严格控制，在终端设备处该序列数一般由网络运营商通过CA系统提供的专用设备烧入解扰器的PROM中，不能再读出。一套CA系统往往为每 个用户分配好几个PDK，以满足丰富的业务需求。运营商对终端用户的加密授权方式有很多种，而智能卡授权方式是目前机顶盒市场的主流，也被我国广电总局确定为我国入网设备的标准配件。
CAS基本原理
假定有两个操作A和B(A和B可能都很复杂)，如果从执行A的线程来看，当另一个线程执行B时，要么将B全部执行完，要么完全不执行B，那么A和B对彼此来说是原子的。 实现原子操作可以使用锁，锁机制，满足基本的需求是没有问题的了，但是有的时候我们的需求并非这么简单，我们需要更有效，更加灵活的机制，synchronized关键字是基于阻塞的锁机制，也就是说当一个线程拥有锁的时候，访问同一资源的其它线程需要等待，直到该线程释放锁， 这里会有些问题：首先，如果被阻塞的线程优先级很高很重要怎么办？其次，如果获得锁的线程一直不释放锁怎么办？（这种情况是非常糟糕的）。还有一种情况，如果有大量的线程来竞争资源，那CPU将会花费大量的时间和资源来处理这些竞争，同时，还有可能出现一些例如死锁之类的情况，最后，其实锁机制是一种比较粗糙，粒度比较大的机制，相对于像计数器这样的需求有点儿过于笨重。 实现原子操作还可以使用当前的处理器基本都支持CAS()的指令，只不过每个厂家所实现的算法并不一样，每一个CAS操作过程都包含三个运算符：一个内存地址V，一个期望的值A和一个新值B，操作的时候如果这个地址上存放的值等于这个期望的值A，则将地址上的值赋为新值B，否则不做任何操作。 CAS的基本思路 就是，如果这个地址上的值和期望的值相等，则给其赋予新值，否则不做任何事儿，但是要返回原值是多少。循环CAS就是在一个循环里不断的做cas操作，直到成功为止。 原子更新基本类型的AtomicInteger，只能更新一个变量，如果要原子更新多个变量，就需要使用这个原子更新引用类型提供的类。Atomic包提供了以下3个类。
crispr/cas9到底是什么东西？大家有关于这个的介绍和资料吗？
最近几年基因编辑技术异常火爆，CRISPR/Cas9技术面世以后，弥补了传统基因编辑技术的诸多不足，使得基因的“任意编辑”变得越来越容易。也因此，CRISPR/Cas9技术当仁不让的成为基因编辑技术的“王牌”，大有一副取而代之的势头。所以这里就给大家简单介绍一下CRISPR/Cas9的技术原理！
一、CRISPR/Cas9系统的构成
CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。
Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
研究人员为了将CRISPR/Cas9技术发展为高效的基因打靶工具，又进行了优化和改造。Cong, L.等人[1]在不影响系统效率的情况下，将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA。通过这种简化，CRISPR/Cas9系统现仅包括两个元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA）。因此现在人们将CRISPR/Cas9技术也称为Cas9/sgRNA技术。
二、CRISPR/Cas9技术的基因编辑机制
CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂（DSB, double strand break）。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：
一是低保真性的非同源末端连接途径（NHEJ，Non-homologous end joining），此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入（Indel），从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变，从而制备基因敲除模式动物。CRISPR/Cas9技术的出现，使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物，且已成功应用于小鼠[5]、大鼠[6]、猪[7]、灵长类[8]、果蝇[9]等等。
第二种DNA断裂修复途径为同源介导的修复（HR, homology-directedrepair），这种基于同源重组的修复机制保真性高，但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍[10]。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如：条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。
CRISPR/Cas9技术以自己操作的便捷性，高效的基因编辑能力获得青睐，成为当下科研工作者的新宠儿。各大实验室纷纷加入开发CARISPR/Cas9技术的行列中，媒体也将之评为21世纪最有影响的十大技术之一。让我们跟随CRISPR/Cas9技术的脚步一起加强科研基础的建设，推动生物科研的进步！
详细信息你可以参考：http://www.bbctg.com.cn/show_2/1733.html
crispr是什么意思
CRISPR基因编辑技术，常被比作“基因剪刀”。CRISPR（/'krɪspər/，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是原核生物基因组内的一段重复序列，是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器。简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR-Cas9系统。利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的基因组上切除，这是细菌特有的免疫系统，是古菌和细菌抵抗病毒等外源遗传物质入侵的一种获得性免疫系统。 微生物学家掌握了细菌拥有多种切除外来病毒基因的免疫功能，其中比较典型的模式是依靠一个复合物，该复合物能在一段RNA指导下，定向寻找目标DNA序列，然后将该序列进行切除。许多细菌免疫复合物都相对复杂，其中科学家掌握了对一种蛋白Cas的操作技术，并先后对多种目标细胞DNA进行切除。这种技术被称为CRISPR/Cas基因编辑系统，迅速成为生命科学最热门的技术。该技术具有非常精准、廉价、易于使用，并且非常强大的特点。 2018年2月，专家预测称，这种基因编辑技术将改变我们的星球，改变我们生活的社会和周围的生物。
Crispr从何而来？
近几十年来，随着全基因组测序技术的不断成熟，我们在各种细菌和古细菌（archaea）中也陆续发现了很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，即CRISPR序列，这就是二十多年前日本科学家发现的那个序列）和CRISPR相关基因（CRISPR-associated genes,Cas gene）。研究发现，这些CRISPR序列与很多病毒或者质粒的DNA序列是互补的，说明这套CRISPR–Cas系统很有可能是生物体抵御病毒等外来入侵者的一套特异性防御机制，就好像是另外一套适应性免疫反应系统（adaptive immune system）。
目录
1CRISPR RNA
2Cas 家族
3作用机制
4小结
1CRISPR RNA编辑
[1-2]
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats RNA，是最近几年才发现的原核生物中的调控RNA，第一次是在1987年在大肠杆菌中有报道，到2000年时，有人证实了，目前为止，已有40%已测序的细菌和90%已测序的古细菌中有报道。CRISPR含有一个与噬菌体和质粒同源的短的重复序列，通过对外来同源的DNA作用对噬菌体有抗性，影响质粒的连接，是原核生物的免疫系统一部分。 CRISPR sequences是一个高度多变的DNA序列，常包含一个550bp的leader 序列和一系列重复单位（repeat-spacer units）。重复序列长度在24-48bp，他们通常会形成二重对称，因此会形成如发夹结构的二级结构，但不是回文结构，重复次数最高可达250 次。重复序列之间被26~72 bp 间隔序列(spacer)隔开, 间隔序列长度与细菌种类和CRISPR 位点有关。在一个原核细胞基因组中通常存在1 至几个CRISPR 位点, 例如在Methanocaldococcus jannaschii 的染色体上已鉴定出18 个不同的CRISPR 位点, 差不多占整个染色体的1%。CRISPR 位点通常定位在原核细胞染色体上, 个别出现在质粒中。CRISPR 的间隔序列与噬菌体或质粒序列存在有同源性, 甚至有一些间隔序列与噬菌体基因组序列同源性为100%, 这表明间隔序列来源于噬菌体基因组。
2Cas 家族编辑
在CRISPR 位点附近, 存在一系列CRISPR相关基因(CRISPR-associated, Cas)，在许多原核生物中都有发现。cas 基因根据其保守程度可分为核心cas 基因, 亚型特异性cas 基因和 RAMP (repeat -associated mysterious proteins)组件基因。在CRISPR 位点的第一个重复序列的上游定位有CRISPR 前导序列(leader sequence), 其功能作为启动子。当CRISPR转录后，Cas 蛋白加工CRISPR RNA成一个沉默RNA，这个沉默RNA就会对外来同源的DNA起到作用。CRISPR-Cas 系统的生物学功能开始是通过计算机分析细菌和古细菌的基因组序列被发现的, 之后得到了实验证实。
3作用机制编辑
目前为止, 虽然对CRISPR-Cas 系统的详细作用机制尚未得到完全阐明, 但已基本明确了它的作用机制的整个过程。CRISPR-Cas 系统的作用机制大体可分为3 个不同阶段，如图：
在噬菌体侵入的起始阶段，Cas 蛋白复合物靶向并裂解噬菌体基因组中短的原型间隔序列(proto-spacer),这些原型间隔序列剪下来整合到宿主基因组中的CRISPR 位点的5′端。然后这些短的掺入的间隔序列被转录成crRNAs(CRISPR RNAs), crRNAs 中除含有间隔序列转录物外, 还含有间隔序列两侧部分重复序列的转录产物。最后阶段是靶向和干扰侵入的噬菌体DNA 序列, 这个过程仍需Cas 蛋白复合物参与。当宿主再被噬菌体感染时, crRNAs 作为模板靶向噬菌体的原型间隔序列，靶向的DNA 序列中是否含有CRISPR 的部分重复序列, 如果含有这部分序列, crRNAs 与之通过碱基配对结合后被干扰降解。
4小结编辑
CRISPR-Cas 系统作为原核细胞的适应性免疫系统, 不但具有真核细胞的特异性和记忆性,而且还具有原核细胞特有的可遗传性，从CRISPR 系统在细菌中分布的广泛性和多样性可以看出, CRISPR 位点是细菌在漫长的进化中不断形成的, 也说明CRISPR 免疫防御系统在原核细胞中可能是最原始的免疫系统之一。CRISPR 位点除了它的防御功能外, 在一些细菌中似乎具有其它功能。如, 在鉴定的两个相关的Thermotoga 菌的基因组中, 有许多大的转位发生在CRISPR位点。
CRISPR-Cas9基因编辑技术简介
CRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内,CRISPR-Cas9技术风靡全球, 成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，成为当今最主流的基因编辑系统。 一、什么是CRISPR-Cas系统 CRISPR-Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统 。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为 CRISPR 的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。 C RISPR-Cas系统包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分。 [图片上传失败...(image-890ed-1634820207331)] 1、CRISPR（/'krɪspər/）是原核生物基因组内的一段重复序列 。CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats（成簇的规律性间隔的短回文重复序列）。分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。 （注：生活在深海的火山口、陆地的热泉以及盐碱湖等极端环境中，有一些独特结构的细菌，称为古细菌） CRISPR基因序列主要由前导序列（leader）、重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）构成 。 ①前导序列 ：富含AT碱基，位于CRISPR基因上游， 被认为是CRISPR序列的启动子 。 ②重复序列 ：长度约20–50 bp碱基且包含5–7 bp回文序列，转录产物可以形成发卡结构， 稳定RNA的整体二级结构 。 ③间隔序列 ： 是被细菌俘获的外源DNA序列 。这就相当于细菌免疫系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。 2、Cas基因位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（ CRISPR associated，Cas ）。 Cas基因编码的Cas蛋白在防御过程中至关重要，目前已经发现了Cas1-Cas10等多种类型的Cas基因。 依据Cas蛋白在细菌免疫防御过程中参与的角色，目前将CRISPR-Cas系统分为两大类。 第一大类 ：它们切割外源核酸的效应因子为多个Cas蛋白形成的复合物，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型。 第二大类 ：它们的作用因子是比较单一的Cas蛋白，比如Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cpf蛋白。 目前，被最为广泛应用的CRISPR系统是II型CRISPR-Cas系统，也就是CRISPR-Cas9系统。 二、CRISPR-Cas9的作用原理 对于CRISPR-Cas9的作用机理可以分为三个阶段来理解。 1、第一阶段：CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 （ 俘获外源DNA，登记“黑名单” ） CRISPR 的高度可变的间隔区获得，其实就是指外来入侵的噬菌体或是质粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于CRRSPR 的5' 端的两个重复序列之间。因此，CRISPR 基因座中的间隔序列从5' 到3' 的排列也记录了外源遗传物质入侵的时间顺序。 新间隔序列的获得可能分为三步： 第1步：Cas1和Cas2编码的蛋白将扫描入侵的DNA，并识别出PAM区域，然后将临近PAM的DNA序列作为候选的原型间隔序列。 [图片上传失败...(image-b6e38b-1634820207330)] 第2步：Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。 第3步：DNA会进行修复，将打开的双链缺口闭合。这样一来，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。 [图片上传失败...(image-4831b9-1634820207330)] 2、第二阶段：CRIPSR 基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工） CRISPR序列在前导区的调控下转录产生pre-crRNA（ crRNA的前体 ），同时与pre-crRNA序列互补的tracrRNA（ 反式激活crRNA ）也被转录出来。pre-crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成双链RNA并与Cas9编码的蛋白组装成一个复合体。它将根据入侵者的类型，选取对应的“身份证号码”（ 间隔序列RNA ），并在核糖核酸酶Ⅲ（ RNaseⅢ ）的协助下对这段“身份证”进行剪切，最终形成一段短小的crRNA（ 包含单一种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区 ）。 crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物，为下一步剪切做好准备。 3、第三阶段：CRISPR/Cas 系统活性的发挥（靶向干扰） crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物就像是一枚制导导弹，可以对入侵者的DNA进行精确的打击。这个复合物将扫描整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的原间隔序列。这时，复合物将定位到PAM/原间隔序列的区域，DNA双链将被解开，形成R-Loop。crRNA将与互补链杂交，而另一条链则保持游离状态。 随后，Cas9蛋白精确的平端切割位点位于PAM上游3个核苷酸位置，形成平末端产物。Cas9蛋白的HNH结构域负责切割与crRNA互补配对的那一条DNA链，而RuvC结构域负责切割另外一条非互补DNA链。最终在Cas9的作用下DNA双链断裂（DSB），外源DNA的表达被沉默，入侵者被一举歼灭。 三、 CRISPR-Cas9基因编辑技术及应用… tracrRNA-crRNA在被融合为单链向导RNA（sgRNA）时也可以发挥指导Cas9的作用。 CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA（guide RNA）来识别目的基因组序列，并引导 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA 进行修饰的目的。 CRISPR-Cas9的广泛应用 1、基因敲除（Knock-out） Cas9可以对靶基因组进行剪切，形成DNA的双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的 非同源末端连接 方式（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，（ 移码突变 ：是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码改变，使原来编码某种肽链的基因变成编码另一种完全不同的肽链序列。）使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。为了提高CRISPR系统的特异性，可将Cas9的一个结构域进行突变，形成只能对DNA单链进行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶。因此想要形成双链断裂的效果可以设计两条sgRNA序列，分别靶向DNA互补的两条链，这样两条sgRNA特异性的结合靶标序列，即可形成DNA断裂，并在修复过程中通过移码突变实现基因敲除 2、基因敲入（Knock-in） 当DNA双链断裂后，如果有DNA修复模板进入到细胞中，基因组断裂部分会依据修复模板进行 同源重组修复 （HDR），从而实现基因敲入。修复模板由需要导入的目标基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）组成，同源臂的长度和位置由编辑序列的大小决定。DNA修复模板可以是线性/双链脱氧核苷酸链，也可以是双链DNA质粒。HDR修复模式在细胞中发生率较低，通常小于10%。为了增加基因敲入的成功率，目前有很多科学家致力于提高HDR效率，将编辑的细胞同步至HDR最活跃的细胞分裂时期，促进修复方式以HDR进行；或者利用化学方法抑制基因进行NHEJ，提高HDR的效率 3、基因抑制、基因激活（Repression or Activation） Cas9的特点是能够自主结合和切割目的基因，通过点突变的方式使Cas9的两个结构域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介导下结合靶基因，而不具备剪切DNA的功能。因此，将dCas9结合到基因的转录起始位点，可以阻断转录的开始，从而抑制基因表达；将dCas9结合到基因的启动子区域也可以结合转录抑制/活化物，使下游靶基因转录受到抑制或激活。因此dCas9与Cas9、Cas9 nickase的不同之处在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不会对基因组DNA造成永久性的改变。 4、多重编辑（Multiplex Editing） 将多个sgRNA质粒转入到细胞中，可同时对多个基因进行编辑，具有基因组功能筛选作用。多重编辑的应用包括：使用双Cas9nickases提高基因敲除的准确率、大范围的基因组缺失及同时编辑不同的基因。通常情况下，一个质粒上可以构建2～7个不同的sgRNA进行多重CRISPR基因编辑。 5、功能基因组筛选 利用CRISPR-Cas9进行基因编辑可以产生大量的基因突变细胞，因此利用这些突变细胞可以确认表型的变化是否是由基因或者遗传因素导致的。基因组筛选的传统方法是shRNA技术，但是shRNA有其局限性：具有很高的脱靶效应以及无法抑制全部基因而形成假阴性的结果。CRISRP-Cas9系统的基因组筛选功能具有高特异性和不可逆性的优势，在基因组筛选中得到了广泛的应用。目前CRISPR的基因组筛选功能应用于筛选对表型有调节作用的相关基因，如对化疗药物或者毒素产生抑制的基因、影响肿瘤迁移的基因以及构建病毒筛选文库对潜在基因进行大范围筛选等。 CRISPR-Cas9基因编辑技术简介 - 知乎 (zhihu.com)
CRISPR/Cas9：基因编辑的历史与发展
[](javascript:void(0);) | CRISPR/Cas系统是细菌和古菌特有的一种天然防御系统，用于抵抗病毒或外源性质粒的侵害。当外源基因入侵时，该防御系统的 CRISPR 序列会表达与入侵基因组序列相识别的 RNA，然后 CRISPR 相关酶(Cas)在序列识别处切割外源基因组DNA，从而达到防御目的。 根据Cas蛋白的特点，可将CRISPR/Cas系统分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系统需要借助复杂的蛋白复合体发挥作用，Ⅱ型系统仅借助 Cas9蛋白和sgRNA即可对靶目标进行编辑，结构简单，操作容易，因此目前主要使用Ⅱ型CRISPR/Cas9 系统。 CRISPR/Cas自诞生以来，迅速发展，已经成为生命科学领域最耀眼、最有前景的技术。尤其是近两年，在全世界科学家的共同努力下，CRISPR/Cas相关新进展新突破不断涌现。 一、基因编辑技术的发展史 基因编辑可以分为三代，第一代：ZFN；第二代：TELEN；第三代：CRISPR/Cas。这三个基因编辑技术都利用了DNA修复机制，所以我们先来了解一下DNA修复机制（ 图1 ）。[图片上传失败...(image-8dab49-1625385468208)] 图1-NHEJ修复（左），HDR修复（右） NHEJ（Non-homologous end joining） 非同源性末端接合 NHEJ修复机制不需要任何模版，修复蛋白直接将双股裂断的DNA末端彼此拉近，在DNA连接酶的帮助下重新接合（ 图1 ）。 HDR（Homology directed repair） 同源重组修复 当细胞核内存在与损伤DNA同源的DNA片段时，HDR才能发生。 NHEJ的机制简单又不依靠模版，因而NHEJ的活性相对于HDR高出许多。但NHEJ修复出错的概率较高，容易造成移码突变等，基因编辑正是利用了这一点（ 图1 ）。 1.ZFN的识别切割机制 融合锌指模块和FokI切割结构域形成ZFN ；以二聚体的形式靶向切割每个锌指结构；特异识别3个碱基 ；组装多个锌指结构(识别12-18bp)形成的ZFN对可特异切割基因组靶点 （ 图2 ）。 [图片上传失败...(image-3f1d8d-1625385468209)] 图2-ZFN基因编辑原理图 2.TALEN的识别切割机制 两个TALE靶向识别靶点两侧的序列；每个TALE融合一个FokI内切酶结构域；FokI通过TALE靶向形成二聚体切割靶点；设计灵活识别特异性强（ 图3 ）。 [图片上传失败...(image-6dcfc-1625385468209)] 图3-TELEN基因编辑原理图 3.CRISPR/Cas9的识别切割机制 crRNA通过碱基配对与 tracrRNA结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA（ 图4 ）。 [图片上传失败...(image-c85235-1625385468209)] 图4-CRISPR/Cas9基因编辑原理图 ZFN、TELEN、CRISPR/Cas9比较 [图片上传失败...(image-dd6344-1625385468209)] 图5-三种基因编辑的比较 二、CRISPR/Cas技术的介绍 CRISPR/Cas9 系统的发现 1987年，在大肠杆菌的基因组中首次发现了一个特殊的重复间隔序列——CRISPR序列，随后，在其他细菌和古菌中也发现了这一特殊序列。 2005年，发现这些CRISPR序列和噬菌体的基因序列匹配度很高，说明CRISPR 可能参与了微生物的免疫防御。 2011年，CRISPR/Cas系统的分子机制被揭示：当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR 转录生成 前体crRNA (pre-crRNA)， pre-crRNA 经过加工形成含有与外源基因匹配序列的crRNA，该crRNA与病毒基因组的同源序列识别后，介导 Cas 蛋白结合并切割，从而保护自身免受入侵。 2013年，发现CRISPR/Cas9系统可高效地编辑基因组。随后张锋等使用CRISPR系统成功的在人类细胞和小鼠细胞中实现了基因编辑。 从此开始，CRISPR/Cas9技术给生命科学领域带来了巨大冲击，CRISPR/Cas9相关研究成果频频登上CNS等顶级期刊，近两年更是成为诺贝尔奖热门候选。 CRISPR/Cas技术的原理 CRISPR/Cas9系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA（trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计 crRNA 和 tracrRNA 这两种 RNA，改造成具有引导作用的sgRNA （single guide RNA ），从而引导 Cas9 对 DNA 的定点切割（图4）。 CRISPR/Cas技术的优势 设计简单，简明的碱基互补设计原则，识别不受基因组甲基化影响，能靶向几乎任意细胞任意序列，方便同时靶向多个靶点，切割效率高。 三、CRISPR/Cas的脱靶效应 PAM**** (Protospacer adjacent motif ) 前间区序列邻近基序 PAM序列区是CRISPR/Cas9系统行使切割功能的基本条件。如果靶序列 3′端没有PAM序列，即使靶序列与sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不会切割该序列位点。 PAM序列主要影响CRISPR/Cas9的DNA切割效率。在细胞水平上，NGG介导的切割效率是最高的。 sgR****NA ****(Single guide RNA ) 向导 RNA sgRNA与目标基因组相结合的 20nt 序列区决定着 CRISPR/Cas 系统的靶向特异性。CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性其实主要依赖于sgRNA与靠近PAM区的10~12 bp的碱基配对，而其余远离PAM序列 8~10 bp 碱基的错配对靶位点识别的影响并不明显。目前研究结果均提示，可能靠近 PAM 的 8~14 bp 序列是决定特异性的关键，其他序列也均在不同程度上影响脱靶效应。 CRISPR/Cas9的脱靶效应给研究带来了一定程度上的不确定性，也是限制其发挥更大潜力的主要原因之一。 2017年5月30日， Nature 杂志子刊 Nature Methods 刊登了美国哥伦比亚大学研究人员的一篇文章，研究人员通过CRISPR/Cas9成功修复了导致小鼠失明的基因后，对小鼠进行全基因测序，发现修复后的小鼠基因组有超过1500个单核苷酸突变，以及超过100个位点发生大片段插入或缺失（ 图6 ）。文章的结论无疑引发了巨大震动，也给正在进行中的CRISPR/Cas9带来了不确定性。 [图片上传失败...(image-f21b76-1625385468208)] 图6--动物体内实验中CRISPR/Cas9编辑后发生意想不到的突变 仔细分析后，发现该文章并不十分严谨，文章仅有两只小鼠作为实验组，一只作为对照组，数量不足以证明结论是否只是个例。而且单碱基突变是生物体内自然现象，不能全归于CRISPR/Cas9。整个实验只基于一个sgRNA数据，且该sgRNA特异性评分很低，造成脱靶效应也应该在预料之中（ 图7 ）。 [图片上传失败...(image-751d94-1625385468208)] 图7--针对 Nature Methods 文章的回应 经过一系列的研究和改进，目前CRISPR系统的脱靶性已经很低，当然，要想达到理想的状态，还有很长的路要走。 四、CRISPR/Cas技术的进展 2016年6月，张锋在 Science 发表文章，发现CRISPR/Cas13a能有切割细菌的特定RNA序列。 2016年9月，Jennifer Doudna在 Nature 发表文章，证实CRISPR/Cas13a可以用于RNA检测。 2017年2月22日，美国纪念斯隆.凯特林癌症中心（MSK）研究人员在 Nature 杂志发文，使用腺相关病毒（AAV）介导，将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于CAR-T疗法。该研究既解决了传统CAR-T疗法的随机整合可能存在的潜在危害，又大大降低了CAR-T细胞发生分化或癌化的风险，赋予了CAR-T技术全新的高效性、稳定性、安全性。 2017年8月2日，Shoukhrat Mitalipov在 Nature 发表长文，使用CRISPR/Cas9技术修正了植入子宫前的人类胚胎中一种和遗传性心脏病有关的变异。该研究证实了通过编辑人类胚胎进行治疗遗传病是安全可行的。值得一提的是，该成果受到了基因编辑领域大牛George Church等人的质疑。 2017年8月11日，杨璐菡等在 Science 发表文章，通过CRISPR/Cas9技术敲除猪基因组中的内源逆转录病毒（PERV）序列，并克隆出多只PERV失活小猪。向最终实现使用猪器官进行人体器官移植的终极目标迈进了一大步。 2017年9月，杂交水稻之父”袁隆平院士宣布使用CRISPR/Cas9技术敲除与镉吸收和积累相关基因的水稻育种成功。该研究从根本上解决了水稻镉污染的问题，将扭转我国部分农作物重金属超标的问题，进而改善部分人群重金属慢性中毒的问题。 2017年10月4日，张锋在 Nature 发表论文证实CRISPR/Cas13a能够在哺乳动物细胞中编辑特定的RNA。CRISPR/Cas13a能够达到RNAi相似的降低基因表达的效率，而且有更强的特异性，且对细胞内天然的转录后调控网络的影响更小。 2017年10月19日，Jennifer Doudna在 Nature 发表文章，设计了高精确性的Cas9变体—HypaCas9。该研究极大地降低了Cas9的脱靶效应，且不降低靶向切割效率。 2017年10月25日，张锋在 Science 发表文章介绍CRISPR新系统--REPAIR，可以高效的进行RNA的单碱基修复。因为不改变DNA序列，所以为通过基因编辑治疗遗传病而又不永久影响基因组提供了新可能。 2017年10月25日，哈佛大学Broad研究所的David Liu实验室在 Nature 发表长文，报道了新型腺嘌呤基因编辑器——ecTadA-dCas9，可以将A·T碱基对转换成G·C碱基对，该技术首次实现了不依赖DNA断裂即可进行基因编辑的技术，即单碱基基因编辑技术。该技术高于其它基因组编辑方法的效率，且几乎没有随机插入、删除或其它突变等不良副作用，因此为今后大范围治疗点突变遗传疾病提供了极大的便利。 五****、展望 近几年CRISPR/Cas基因编辑技术飞速发展，推广应用到了生物、医学、农业以及环境等多个领域，造就了一批批科研奇迹，尤其是在遗传病的治疗、疾病相关基因的筛查与检测、肿瘤治疗以及动植物的改造、病原微生物防治等领域有着巨大的潜力，也将深远地影响整个世界。 特别感谢：BioArt主编给予的帮助和意见以及吉满生物吴晨提供图1-图5的图片。 | | |
什么是CRISPR
CRISPR是“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”的缩写，中文意思为“聚集规律间隔短回文重复序列”。CRISPR技术是一种基因编辑技术，能够实现对生物基因组的精确编辑。它最初是由细菌和古菌体系中发现的一种天然的免疫系统，用来保护生物免受病毒和外源DNA的侵害。CRISPR技术利用了这种天然免疫系统的原理，通过设计指向目标基因的RNA序列，使之与一个特定的酶结合形成CRISPR-Cas9复合物，再把这个复合物引导到目标基因上，能够针对基因组DNA进行定点的剪切和编辑，实现对基因组的修饰和调控。CRISPR技术具有高效、低成本、易操作等优点，已经成为当前基因编辑领域内的主流技术，并广泛应用于生物医学研究、农业和生物工程等领域。该技术的发展还带来了许多新的机会和挑战，也引起了广泛的关注和讨论。【摘要】
什么是CRISPR【提问】
CRISPR是“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”的缩写，中文意思为“聚集规律间隔短回文重复序列”。CRISPR技术是一种基因编辑技术，能够实现对生物基因组的精确编辑。它最初是由细菌和古菌体系中发现的一种天然的免疫系统，用来保护生物免受病毒和外源DNA的侵害。CRISPR技术利用了这种天然免疫系统的原理，通过设计指向目标基因的RNA序列，使之与一个特定的酶结合形成CRISPR-Cas9复合物，再把这个复合物引导到目标基因上，能够针对基因组DNA进行定点的剪切和编辑，实现对基因组的修饰和调控。CRISPR技术具有高效、低成本、易操作等优点，已经成为当前基因编辑领域内的主流技术，并广泛应用于生物医学研究、农业和生物工程等领域。该技术的发展还带来了许多新的机会和挑战，也引起了广泛的关注和讨论。【回答】
简述新冠病毒灭活疫苗的开发过程【提问】
新冠病毒灭活疫苗的开发过程可以大致分为以下几个步骤：病毒分离：首先，需要从患者的样本中分离新冠病毒，并培养其在体外的病毒库。病毒灭活：接下来，使用物理或化学方法对分离出的新冠病毒进行灭活，使其失去感染性但仍具有免疫原性。疫苗制备：将灭活后的病毒注入到适当的载体中，加入辅料和佐剂等成分，制备成疫苗。动物试验：进行动物试验，评估疫苗的安全性、免疫原性、剂量和免疫程序等方面。临床试验：通过临床试验分为三个阶段，以验证人类对疫苗的安全性和有效性。第一阶段主要评估疫苗的安全性和剂量反应关系；第二阶段进一步评估疫苗的免疫原性和剂量响应关系；第三阶段是大规模随机双盲测试，评估疫苗在真实环境下的安全性和有效性。生产上市：经过各项测试和评估后，通过政府监管部门审批，最终生产和上市供给公众。【回答】
新冠病毒灭活疫苗的作用机制【提问】
新冠病毒灭活疫苗的作用机制主要是通过疫苗激发人体免疫系统产生特异性免疫反应，生成针对新冠病毒的抗体和细胞免疫反应，从而达到预防感染和减轻疾病严重程度的目的。具体来说，当新冠病毒灭活疫苗被注射到人体内时，其中的灭活病毒会被免疫系统识别为外来物质并激发免疫反应。这种免疫反应既包括体液免疫反应（即产生针对病毒表面抗原的抗体），也包括细胞免疫反应（即刺激T淋巴细胞攻击被感染的细胞或病毒颗粒）。当接触到真实的新冠病毒时，已经生成的抗体和T淋巴细胞能够快速识别并消灭病毒，从而避免病毒在人体内大量繁殖并引起严重的疾病。因此，新冠病毒灭活疫苗能够有效预防新冠病毒感染，并在全球范围内被广泛应用于疫苗接种。【回答】
简述辛伐他汀的来源【提问】
简述辛伐他汀的来源【回答】
辛伐他汀是一种用于降低血脂的药物，其源于日本的一种红曲菌（Monascus purpureus）。红曲菌在中国、日本等地被广泛应用于食品加工中，比如制作红酒、豆腐乳等。这种真菌可以产生亮红色素，也就是所谓的红曲色素。20世纪70年代，日本研究人员发现，吃红曲菌发酵的米饭的人群更少患心血管疾病，这启发了科学家进一步研究红曲菌的成分。最终，他们从红曲菌中分离出了一种名为红曲霉素的物质，它能够抑制胆固醇合成酶的活性，进而减少体内胆固醇的合成和吸收。在进一步的研究和开发过程中，科学家对红曲霉素进行了结构改造，并命名为“辛伐他汀”，于是这种药物就诞生了。辛伐他汀是第一代他汀类药物，于1987年开始上市使用。随着对其作用机制的深入研究和临床应用的推广，辛伐他汀已成为降低血脂和预防心血[Something went wrong, please try again later.]【回答】
辛伐他汀的生产方式【提问】
辛伐他汀的生产过程主要分为两个部分：首先是通过发酵生产红曲菌素作为原料，然后经过化学合成得到辛伐他汀。具体来说，红曲菌素是由红曲菌发酵生产而来的，可以通过以下步骤进行生产：将红曲菌种植在适当的培养基上，进行发酵；收获发酵液，经过离心、过滤等操作，获得含有红曲菌素的溶液；对溶液进行提纯和结晶，可以得到红曲菌素。得到红曲菌素的原料之后，再进行化学合成制备辛伐他汀。具体的合成方法比较复杂，需要经历多道化学反应，并进行精细的分离纯化，最终才能得到高纯度的辛伐他汀。【回答】
辛伐他汀的作用机制【提问】
辛伐他汀的作用机制主要是通过抑制胆固醇合成酶（HMG-CoA还原酶）的活性，从而降低体内胆固醇的合成和吸收，达到降低血脂的效果。具体来说，HMG-CoA还原酶是人体体内合成胆固醇和其他类固醇物质的关键酶。辛伐他汀作为一种HMG-CoA还原酶抑制剂，能够与这种酶结合并抑制其活性，进而减少体内胆固醇的合成和吸收。当人体摄入食物中的胆固醇和脂质时，肝脏和其他组织会通过HMG-CoA还原酶合成胆固醇。但当辛伐他汀阻断了HMG-CoA还原酶的活性，体内就会缺少足够的胆固醇，因此肝脏会从血液中回收已有的胆固醇，而不再发挥新生胆固醇的作用。这样，血液中的总胆固醇和LDL-C浓度就会降低，同时高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的浓度会升高，从而达到降低血脂和预防心血管疾病的效果。值得注意的是，辛伐他汀不仅可以降低血脂，还具有抗炎、抗氧化和抗血小板聚集等作用，进一步保护心血管健康。【回答】
什么是CRISPR
你好！CRISPR是一种基因编辑技术全称为“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”（聚集规间隔短回文重复序列）。它最初是从细菌的免疫系统中发现的，用于识别并摧毁入侵的病毒基因。CRISPR技术利用一种叫做“CRISPR-Cas9”的酶来切割DNA分子，从而实现对基因组的。通过将CRISPR-Cas9与特定的RNA序列配对，科学家可以将其引导到特定的基因序列上，然后利用Cas9酶切割DNA，从而实现对基因的修改、删除或替换。CRISPR技术具有高效、精准、简便、低成本等优点，被广泛应用于生物医学研究、农业、环境保护等领域。【摘要】
什么是CRISPR【提问】
你好！CRISPR是一种基因编辑技术全称为“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”（聚集规间隔短回文重复序列）。它最初是从细菌的免疫系统中发现的，用于识别并摧毁入侵的病毒基因。CRISPR技术利用一种叫做“CRISPR-Cas9”的酶来切割DNA分子，从而实现对基因组的。通过将CRISPR-Cas9与特定的RNA序列配对，科学家可以将其引导到特定的基因序列上，然后利用Cas9酶切割DNA，从而实现对基因的修改、删除或替换。CRISPR技术具有高效、精准、简便、低成本等优点，被广泛应用于生物医学研究、农业、环境保护等领域。【回答】
